1. 為什么要做單細(xì)胞RNA測(cè)序(ScRNA-seq)?
主要解決的問題主要有兩個(gè)：一是異質(zhì)性(heterogeneity)，比如a)鑒定某些因?yàn)楹?比例)較低而在常規(guī)RNA測(cè)序檢測(cè)時(shí)被“掩蓋”的細(xì)胞亞群;b) 檢測(cè)細(xì)胞群體中不同的個(gè)體細(xì)胞：比如表達(dá)不同TCR的T細(xì)胞，胚胎發(fā)育早期的各個(gè)細(xì)胞等;c)追蹤某群細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞間的譜系(lineage)或發(fā)育關(guān)系;二是獲得基因表達(dá)、剪接等信息以及根據(jù)這些信息構(gòu)建的調(diào)控關(guān)系。
2. 做單細(xì)胞測(cè)序的基本步驟是什么?
如上圖所示，共分為9個(gè)步驟：
1)單細(xì)胞分離;
2) 保留mRNA的細(xì)胞裂解;
3) mRNA捕獲;
4)RNA反轉(zhuǎn)成cDNA;
5)cDNA擴(kuò)增;
6)cDNA測(cè)序文庫制備;
7)序列文庫混樣(pooling);
8)生物信息學(xué)工具進(jìn)行質(zhì)控;
9)專業(yè)的工具進(jìn)行分析和結(jié)果展示;
3. 單細(xì)胞測(cè)序檢測(cè)的樣品類型有哪些?
理論上說，任何的真核細(xì)胞都可以進(jìn)行scRNA-seq檢測(cè)。但在實(shí)際操作過程中，需要注意的是：1)從組織(特別是實(shí)體組織)中獲得細(xì)胞的數(shù)量和活性;2) 在獲取過程中人為操作對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響，以避免出現(xiàn)人為因素的轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化。當(dāng)然從技術(shù)上說，除了分離單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)外，還可以直接分離細(xì)胞核(nuclei)進(jìn)行測(cè)序。
4. 單細(xì)胞測(cè)序的方法選擇?
總體上有大約20種protocol，各個(gè)protocol的比較如下圖所示：
我們可以看到轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度包括了：全長(zhǎng)(Full length)和3’端測(cè)序，需要注意的是對(duì)于表達(dá)量較低的RNA來說更推薦全長(zhǎng)測(cè)序。其它的信息還包括了測(cè)序的平臺(tái)(Droplet、Nanowell等)、測(cè)序通量(細(xì)胞的數(shù)量)、測(cè)序深度、反應(yīng)體系和參考文獻(xiàn)等。
另外，在評(píng)估技術(shù)差異的時(shí)候常用的兩種策略是“Spike-in”和“UMI”，兩者的定義：
Spike-in：A molecule or a set of molecules introduced to the sample in order to calibrate measurements and account for technical variation; commonly used examples include external RNA control consortium (ERCC) controls (Ambion/Thermo Fisher Scientific) and Spike-in RNA variant control mixes (SIRVs, Lexogen);
UMI(Unique molecular identifier) :A variation of barcoding, in which the RNA molecules to be amplified are tagged with random n-mer oligonucleotides. The number of distinct tags is designed to significantly exceed the number of copies of each transcript species to be amplified, resulting in uniquely tagged molecules, and allowing control for amplification biases.
5. 需要測(cè)定的細(xì)胞數(shù)量以及測(cè)序深度該如何確定?
總體上說，大家需要考慮的因素包括研究目的、細(xì)胞的異質(zhì)性大小、平臺(tái)和價(jià)格。一般來說，異質(zhì)性越高，我們需要檢測(cè)的細(xì)胞亞群比例越低，需要測(cè)定的細(xì)胞數(shù)量就越多，大家可以類比考慮，比如A袋子有5個(gè)紅球、5個(gè)藍(lán)球組成;B袋子有赤橙黃綠青藍(lán)紫7個(gè)顏色組成的10個(gè)球，其中我們關(guān)心的藍(lán)球只有1個(gè)，如果我們想抽到籃球，是不是要抽更多次B袋子?
6. 單細(xì)胞RNA測(cè)序與常規(guī)RNA測(cè)序的區(qū)別是什么?
主要有三點(diǎn)：
1) 單細(xì)胞測(cè)序中某些低風(fēng)度的轉(zhuǎn)錄本不能被檢測(cè)到;
2)單細(xì)胞測(cè)序比常規(guī)測(cè)序的會(huì)有更高的技術(shù)誤差(包括檢測(cè)噪音等);
3)單細(xì)胞測(cè)序檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄本量的分布上更加復(fù)雜，一般是符合負(fù)二項(xiàng)分布的，但也出現(xiàn)其它的分布，因此在選擇統(tǒng)計(jì)方法時(shí)一定要特別注意。
7. 單細(xì)胞RNA測(cè)序的分析該如何做?
這一部分我們下次單獨(dú)寫一期文章來介紹。
8. 單細(xì)胞RNA測(cè)序未來5年的前景如何?
主要包括幾點(diǎn)：
1) 對(duì)檢測(cè)細(xì)胞(樣本)的要求降低：從新鮮細(xì)胞到冷凍保存的細(xì)胞;
2)性價(jià)比的提高：包括了平臺(tái)技術(shù)的進(jìn)步導(dǎo)致價(jià)格進(jìn)一步降低和檢測(cè)通量的增加：
3)對(duì)低豐度RNA檢測(cè)的問題;
4)新的生信工具和軟件的出現(xiàn)：后面我們會(huì)為大家介紹一個(gè)數(shù)據(jù)庫——SCPortalen，來看別人的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)數(shù)據(jù)的挖掘使用。
5)與其它技術(shù)的聯(lián)合：比如Crispr;
6)臨床應(yīng)用：按照這篇文章的觀點(diǎn)，單細(xì)胞測(cè)序往臨床上用的時(shí)間點(diǎn)大約在5年。
9. 單細(xì)胞RNA測(cè)序在病毒學(xué)上的應(yīng)用?
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