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單細胞測序技術(shù)及其在傳染病研究領(lǐng)域中的應(yīng)用
行業(yè)新聞 2018-11-13
　　同一組織中的細胞往往被認為是具有相同狀態(tài)的功能單位，因此傳統(tǒng)的測序技術(shù)分析的是細胞群體的總體平均反應(yīng)。然而由于細胞存在異質(zhì)性，即使是來自同一細胞系或者相同細胞，由于基因組和表觀基因組的重編程(reprogramming)、DNA復(fù)制錯誤等會產(chǎn)生不同的基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組。而單細胞測序技術(shù)(single-cell sequencing，SCS)可以檢測單個細胞DNA水平的單核苷酸變異(single nucleotide variations，SNVs)、拷貝數(shù)變化(copy number variatons，CNVs)和基因組結(jié)構(gòu)的變化，還可以檢測單個細胞RNA水平的基因表達、基因融合和選擇性剪切等，以及DNA甲基化、組蛋白修飾等。近十年來，單細胞測序技術(shù)得到了迅猛的發(fā)展，已經(jīng)應(yīng)用在醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)和免疫學(xué)等多個領(lǐng)域。本文將對單細胞測序技術(shù)的方法和應(yīng)用進行總結(jié)，并對其在傳染病研究中的應(yīng)用進行介紹。

　　單細胞測序技術(shù)的方法

　　隨著測序技術(shù)的不斷創(chuàng)新，對細胞分子的研究逐漸從細胞群體發(fā)展到單個細胞樣本。早期使用低通量的免疫熒光、單細胞PCR(single-cell PCR)和單細胞實時PCR等技術(shù)檢測單細胞的分子標記。下一代測序(next generation sequencing，NGS)技術(shù)的發(fā)展為實現(xiàn)單細胞測序技術(shù)提供了新的可能。2009 年Tang等采用mRNA全轉(zhuǎn)錄組測序法對小鼠單個四細胞期胚胎的卵裂球轉(zhuǎn)錄組進行了單細胞水平分析。單細胞測序工作已經(jīng)迅速擴展到整個基因組序列。

　　單細胞測序主要包括單細胞DNA測序、RNA測序和表觀基因組測序，這三種測序類型可以從不同角度揭示細胞各個階段的功能和特點。其中表觀基因組測序可以揭示DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)可及性、蛋白質(zhì)-DNA相互作用和染色體的空間結(jié)構(gòu))等不同方面的基因調(diào)控。

　　單細胞測序主要包括以下4個步驟：單細胞分離，核酸序列擴增，基因測序和數(shù)據(jù)分析。其中單細胞分離方法和核酸序列擴增策略是實現(xiàn)單細胞測序的核心技術(shù)。

單細胞測序技術(shù)及其在傳染病研究領(lǐng)域中的應(yīng)用講解

　　單細胞分離

　　顯微操作法(micromanipulation)是比較普遍的直視分選細胞技術(shù)，成本低廉，但是通量低，需要投入大量人力，并且容易對細胞造成機械性損傷，不利于規(guī)?；瘧?yīng)用。而激光捕獲顯微切割技術(shù)(laser capture microdissection，LCM)可以快速獲取單個細胞，但是成本較高、通量低，并且該方法容易導(dǎo)致染色體片段丟失，還經(jīng)常造成RNA降解。

　　目前常用的單細胞分離技術(shù)是熒光激活細胞分選(fl uorescence-activated cell sorting，F(xiàn) ACS)。該方法與前述方法不同，可以高通量、自動化地分離單個細胞，是目前應(yīng)用最多的單細胞分離技術(shù)。該方法通過細胞的物理特性(如細胞大小、熒光散射度)和特異性的分子標記對靶細胞進行識別和分離。FACS法需要大量的細胞懸液，并且該方法檢測的熒光信號強度有限，因此不適用于分選低豐度的細胞。

　　近幾年發(fā)展的微 流控技術(shù)(microfl uidics)利用微流控芯片上的微管道進行多種單細胞分選。該方法需要的樣本量較少，試劑損耗低，細胞污染率低，可以進行規(guī)?；耐茝V和應(yīng)用。因此，微流控技術(shù)是目前最理想的單細胞分離方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。

　　核酸序列擴增

　　與常規(guī)的群體細胞提取的核酸不同，單個細胞所含的DNA或RNA的含量僅為皮克水平，遠遠低于任何測序技術(shù)所需的核酸量。因此通過全基因組擴增(whole-genome amplifi cation，WGA) 和全轉(zhuǎn)錄組擴增(whole-transcriptome amplifi cation，WTA)，獲取高保真、無偏向性的足量DNA或RNA就成為單細胞測序的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

　　全基因組擴增

　　在NGS技術(shù)之前，單細胞基因組擴增多是基于PCR法， 如連接錨定PCR(l igation-anchored PCR，LA-PCR)、引物延伸與擴增PCR(p rimer extension pre-amplifi cation PCR，PEP-PCR)和簡并寡核苷酸引物PCR(d egeneration oligonucleotide primed PCR，DOP-PCR)。這些方法都存在擴增效率低，且會產(chǎn)生非特異性擴增的問題。基于等溫反應(yīng)的多重置換法(multiple displacement amplifi cation，MDA)是常用的全基因組擴增技術(shù)。MDA技術(shù)主要使用φ29DNA聚合酶，在恒溫下對DNA進行高效的指數(shù)擴增，獲得高保真、均一完整的全基因組序列。但是MDA技術(shù)會產(chǎn)生顯著的非特異性擴增。而多重退火環(huán)狀循環(huán)擴增法(multiple annealing and looping-based amplifi cation cycles，MALBAC)則采用線性擴增方式，可獲得一致性好、偏倚少的全基因組DNA，顯著提高單細胞測序的精確度。MALBAC的擴增效率相對MDA較低，也會產(chǎn)生較高的假陽性率。

　　Stepanauskas等提出了一種組合MDA和FACS并改進的方法，即WGA-X。該方法增強了單個微生物細胞和病毒顆粒的基因組回收效率，同時保持了易用性和可擴展性，因此可以從未培養(yǎng)的微生物細胞和環(huán)境樣品中的病毒顆粒中獲得基因組序列和細胞大小信息。

　　全轉(zhuǎn)錄組擴增

　　單細胞轉(zhuǎn)錄組擴增的方法主要有唐 氏法(Tang’s method)、Smart-seq、Smart-seq2、Quarz-seq、線性擴法(c ell expression by liner amplification and sequencing，CEL-seq)，單細胞標記的逆轉(zhuǎn)錄(s ingle-cell tagged reverse-transcription，STRT)和定量的單細胞RNA測序(q uantitative single-cell RNA-seq)等。其中Smart-seq 和Smart-seq2 通過模板轉(zhuǎn)換技術(shù)，能夠獲得全長的RNA，不僅可以檢測基因表達情況，還可以研究單個細胞的選擇性剪切，鑒定新的轉(zhuǎn)錄本。

　　單細胞測序技術(shù)的應(yīng)用

　　隨著單細胞測序技術(shù)的迅速發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用在多個領(lǐng)域，如用于研究腫瘤的發(fā)生和演變、對腫瘤臨床檢測等。利用單細胞測序技術(shù)可以定量分析實體瘤和循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)的異質(zhì)性，檢測有重要作用的罕見細胞，發(fā)現(xiàn)克隆演變(clonal evolution)等。因此，可以利用該技術(shù)預(yù)測和監(jiān)控治療效果和預(yù)后情況、監(jiān)測疾病進展、檢測耐藥等，實現(xiàn)個體化精準醫(yī)療。例如Tirosh等利用單細胞RNA測序技術(shù)分析了4645 個轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性、腫瘤細胞分期和腫瘤微環(huán)境等。而Lohr等從多發(fā)性骨髓瘤病人中分離到335個腫瘤細胞，利用DNA測序技術(shù)監(jiān)測治療效果和基因突變。

　　此外，單細胞測序技術(shù)還應(yīng)用在胚胎學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)等多個方面，如病原微生物檢測、傳染病診斷、宿主免疫應(yīng)答、抗體篩選等等。下文將主要介紹單細胞測序技術(shù)在傳染病研究領(lǐng)域的應(yīng)用。

單細胞測序技術(shù)及其在傳染病研究領(lǐng)域中的應(yīng)用講解

　　單細胞測序技術(shù)在傳染病研究領(lǐng)域的應(yīng)用

　　利用單細胞測序技術(shù)，可以研究單細胞水平上病原微生物和宿主細胞的基因組或轉(zhuǎn)錄組。通過分析病原微生物的核酸序列，可以檢測和鑒定新的微生物物種，了解微生物的分子進化機制，研究病毒感染的動力學(xué);而通過分析宿主細胞轉(zhuǎn)錄組，可以探討細胞異質(zhì)性對病毒生命周期的影響，以及病毒引起的宿主免疫應(yīng)答。

　　在微生物檢測進化及傳染病診斷方面的應(yīng)用

　　單細 胞測序技術(shù)之前，由于很多微生物難以培養(yǎng)，科學(xué)家們無法破譯其基因組結(jié)構(gòu)。微生物的單細胞測序技術(shù)可用于研究未培養(yǎng)微生物的代謝潛力、相互作用和進化情況，發(fā)現(xiàn)新的微生物物種，大大促進人類微生物組計劃的發(fā)展。利用單細胞測序技術(shù)不僅可以檢測未知的病原微生物，還可以監(jiān)測到耐藥株的出現(xiàn)，跟蹤病原體的抗性，從而進行傳染病的診斷。單細胞基因組學(xué)在傳染病領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，如單個細胞中的病毒感染動力學(xué)，病原體的抗性和傳播跟蹤，靶向或非靶向的病原基因組的恢復(fù)，致病新病原菌鑒定等。

　　鑒于細胞異質(zhì)性的存在，在單細胞水平上理解病毒的遺傳結(jié)構(gòu)是至關(guān)重要的。Combe等對水泡性口炎病毒感染的90個單細胞的881個病毒斑進行測序，發(fā)現(xiàn)單個感染單元內(nèi)存在多個基因差異的病毒基因組。Guo等開發(fā)了一種基于微流控技術(shù)的高通量平臺，用于分析單細胞中病毒感染的動力學(xué)。他們已研究了達千個脊髓灰質(zhì)炎病毒感染的單個細胞，分析了其病毒感染的動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)抗病毒藥物可以選擇性地消滅病毒種群中的成員。這促進了毒力因子的發(fā)現(xiàn)和特性鑒定，闡明了病毒種群逃避藥物的作用機制。Yang 等]調(diào)查了乙肝病毒感染情況，并在單細胞水平上量化了胞內(nèi)病毒核酸的數(shù)量，即細胞質(zhì)vRNA和vDNA，以及核共價封閉的環(huán)狀DNA(covalently-closed circular DNAs，cccDNAs)。

　　利用單細胞測序技術(shù)不僅可以精細化識別微生物基因組變異，進行病原微生物進化及溯源研究，還可以在單細胞水平上研究病毒感染的動力學(xué)，定義病原微生物的代謝特征、致病潛力和耐藥性，進行疾病診斷。這有助于闡明病原微生物與宿主之間的相互作用機制，會對傳染病防控和人類健康領(lǐng)域帶來重要影響。

　　在宿主免疫應(yīng)答方面的應(yīng)用

　　宿主對病原微生物的免疫應(yīng)答研究通常是針對群體細胞。然而，這種群體細胞研究難以區(qū)分大細胞群體的弱反應(yīng)和小細胞群體的強反應(yīng);即使同源細胞也存在功能上的異質(zhì)性。單細胞測序技術(shù)可以獲得宿主應(yīng)答的內(nèi)在異質(zhì)性，精準評估免疫細胞被激活的分子機制。目前單細胞測序技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在鑒定罕見的T細胞，分析細胞黏附分子，研究固有淋巴細胞的異質(zhì)性，篩選中和性抗體等。Holt等利用單細胞測序技術(shù)鑒定了罕見的CD4陽性的T細胞。Yu 等利用單細胞RNA測序技術(shù)對小鼠骨髓祖細胞進行分析，發(fā)現(xiàn)了固有淋巴細胞ILC2發(fā)育早期的免疫檢查點PD-1hiIL-25Rhi，從新的角度剖析PD-1和PD-L1在免疫治療中的作用。Tanaka等[33]針對人類T淋巴細胞白血病病毒1 型(human T-cell lymphotropic virus type 1，HTLV-1)特異的CTL細胞的T細胞受體庫進行單細胞測序，發(fā)現(xiàn)移植前后骨髓和外周血CTL細胞的寡克隆多樣性受到高度限制。

單細胞測序技術(shù)及其在傳染病研究領(lǐng)域中的應(yīng)用講解
　　在抗體篩選中的應(yīng)用

　　目前大規(guī)模篩選抗體的方法主要是通過噬菌體、酵母等抗體文庫。所獲取的抗體存在一定的弊端：抗體是重鏈和輕鏈的隨機配對，掩蓋了自然的體液免疫反應(yīng);需要進行大量的實驗;篩選出的中和抗體往往只具有有限的中和功能。

　　而單細胞測序技術(shù)給抗體篩選帶來了重大變革。利用該技術(shù)可以從病人外周血淋巴細胞中獲得抗原特異性的單個記憶性B細胞，并針對單個細胞的抗體的重鏈 和輕鏈進行RT-PCR，從而獲得人源的單克隆抗體。單個 B細胞測序技術(shù)可以快速、高效地分離鑒定出抗原特異性的中和抗體，具有廣闊的應(yīng)用前景。

　　目前，利用單個B細胞測序技術(shù)已經(jīng)篩選和鑒定出多種病毒的中和抗體。Scheid等利用FACS法從感染艾滋病毒的患者中分離到對HIV抗原有親和力的記憶性B細胞，并從中篩選到大量的HIV-1特異性的中和抗體。Tsioris等通過單細胞測序技術(shù)從人B細胞中鑒定出針對西尼羅河病毒的中和抗體。Wang等從中國寨卡康復(fù)病人體內(nèi)鑒定出高效、特異的寨卡病毒單克隆抗體。該抗體能在小鼠模型上有效治療寨卡病毒感染，有望成為治療寨卡病毒感染的候選藥物。類似地，Cox 等從人抗原特異性記憶B細胞中篩選到登革病毒的中和抗體。

　　單細胞測序技術(shù)的出現(xiàn)是生物學(xué)領(lǐng)域的一個里程碑。經(jīng)過近幾年的發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)大量應(yīng)用在腫瘤研究、臨床檢測、免疫應(yīng)答、抗體篩選和微生物鑒定等各個領(lǐng)域。該技術(shù)不僅可以對未培養(yǎng)的病原微生物直接測序，還可以快速、高效地篩選出抗原特異的人源中和抗體，以應(yīng)對新發(fā)和突發(fā)的傳染性疾病。

　　但是該技術(shù)仍處在不斷完善和發(fā)展的階段，還存在以下方面亟需改進：①在前期細胞樣本的采集和保存階段，務(wù)必要保證細胞樣本新鮮，或者加入有效的保護劑;②單細胞分選時還可能存在細胞交叉污染、細胞損傷等問題，期望未來微流控芯片技術(shù)能夠不斷改進，大大提高單細胞分選的效率;③DNA或RNA擴增中仍然存在擴增失敗，或者產(chǎn)生很多非特異性產(chǎn)物情況，需要嚴格控制實驗條件，同時也期待擴增技術(shù)的不斷改進。此外，使用單細胞測序技術(shù)的成本仍然很高，影響了其在臨床檢測的應(yīng)用和推廣。

　　隨著單細胞多組學(xué)測序技術(shù)(single-cell multiomics sequencing)的發(fā)展，未來有望利用該技術(shù)在單細胞水平進行基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀基因組和蛋白質(zhì)組等多種組學(xué)的綜合研究，從而更加系統(tǒng)全面地分析單個細胞、細菌或病毒的功能，進而實現(xiàn)精準醫(yī)療，加強傳染病防控。



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